Несмотря на приоритетную терапевтическую направленность, методики редактирования генома также рассматриваются как способ выведения живых организмов с заранее заданными свойствами. Помимо этических ограничений, проведение таких экспериментов сопряжено с рядом технических трудностей: например, в качестве модели в них могут выступать только животные, геном которых хорошо изучен. В новой работе сотрудники Калифорнийского университета в Риверсайде и других вузов использовали для этих целей наездников вида N. vitripennis. Известно, что эти миниатюрные насекомые откладывают яйца на хозяйских куколок и сами являются носителями эндосимбионтов (Arsenophonus nasoniae), которые за счет манипуляций с митозом могут уничтожать гаплоидных самцов, развивающихся путем партеногенеза. При этом диплоидные самки вида не подвергаются влиянию симбионта и численно доминируют в популяции.
Ранее новые методы изучения генома, в частности высокопроизводительное секвенирование, позволили использовать N. vitripennis для исследования сложных генетических и молекулярных процессов, включая продукцию яда и развитие гаплоидии. Тем не менее, до сих пор направленный мутагенез насекомых осуществить не удавалось: отчасти это связывается со сложностями методик TALEN и ZNF. Чтобы упростить процедуру, авторы применили методику CRISPR/Cas9, целью которой стало разрушение гена NV14284, кодирующего кинуренин-гидроксилазу — фермент, обеспечивающий пигментацию (в случае наездников — черным цветом) глаз. На первом этапе они сконструировали несколько направляющих РНК (sgRNA-1, -2, -3) с мишенью на третьем или четвертом экзоне гена. Тесты показали, что подходящей мишенью является третий экзон, после чего насекомым вводили кассеты CRISPR разного состава.
Ученые вводили эмбрионам наездников кассеты с разным объемом sgRNA и нуклеазой Cas9 и опытным путем установили, что оптимальным является соотношение 160 нанограммов на микролитр и 160 нанограммов на микролитр соответственно. После введения кассеты CRISPR на стадии пре-бластодермы эмбрионов возвращали на хозяйские куколки, где те продолжали рост. Спустя 19 дней инкубационный период завершился, и группа получила взрослых особей N. vitripennis. Согласно анализу, 32–36 процентов насекомых после микроинъекций sgRNA-1 и sgRNA-3 имели фасеточные глаза не черного, а красного цвета, тогда как для sgRNA-2 показатель составил 10 процентов. В ряде случаев наездники обладали только одним красным и одним черным глазом. Выживаемость мутантных особей составила 22–27 процентов, что, по мнению авторов, в целом указывает на эффективность методики и возможности для ее дальнейших тестов.
Статья опубликована в журнале Scientific Reports.
Ранее исследователи начали клинические испытания CRISPR/Cas9 на людях. Первым пациентом стал житель Китая с метастазировавшим немелкоклеточным раком.
Наука
Денис Стригун
