SHERLOCK отыщет мутации на уровне РНК — Naked Science
14.04.2017
Редакция

SHERLOCK отыщет мутации на уровне РНК

Американские ученые разработали быстрый и недорогой метод высокоточной детекции нуклеиновых кислот на основе системы CRISPR-Cas13a.

f9a6efa612edafe4ef363f2248a91ff0
©Wikipedia

Cas13a — бактериальная эндонуклеаза, способная распознавать специфическую последовательность РНК и разрезать схожие нити, расположенные поблизости. Функционально этот фермент аналогичен Cas9, который рассматривается как один из наиболее перспективных способов редактирования генома. По сравнению с последней, Cas13a обладает рядом отличий: во-первых, она вносит в целевую молекулу не разрыв, но полностью уничтожает ее, а во-вторых, работает на уровне РНК (Cas9 рассчитана на ДНК). Эти свойства делают Cas13a неподходящей для геномного редактирования, однако позволяют использовать в иных целях.

 

В новой работе сотрудники Массачусетского технологического института и других учреждений испытали возможности новой системы. Для этого Cas13a патогенной бактерии Leptotrichia shahii инкубировали с репортерной РНК, целевой РНК (ssRNA 1) и CRISPR РНК (crRNA). В кассете последней при этом были закодированы фрагменты ssRNA 1 — она служит для нуклеазы «шпаргалкой» при поиске мишени. Анализ показал, что система хорошо справляется с детекцией in vitro, однако для достижения аттомолярной чувствительности авторам потребовалось подобрать оптимальные условия предварительной амлификации (увеличения нуклеиновых кислот). Нужного уровня точности удалось достичь путем рекомбиназной полимеразной амплификации (увеличения числа копий ДНК).

 

Схема работы SHERLOCK. После конвертации ДНК в РНК в «библиотеке» последней находят мишень с помощью CRISPR-Cas13a, несущей эталон целевой последовательности. Разрушение РНК приводит к флуоресценции / ©Jonathan S. Gootenberg et al., Science, 2017

 

После конвертации ДНК в РНК Cas13a детектировал целевую последовательность, сравнивая ее с закодированной в CRISPR, и разрезал другие РНК. Нуклеаза также уничтожила репортерную РНК — на обнаружение мишени указывала флуоресценция поврежденной молекулы. Методы цифровой капельной полимеразной цепной реакции (ПЦР) — одного из основных способов детекции нуклеиновых кислот — подтвердили, что для работы новой системе необходима только одна молекула ДНК или РНК. При этом, по сравнению с традиционными техниками, она обладает меньшей вариабельностью результатов при многократных повторах.

 

Эффективность системы, получившей название SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing), тестировалась на лентивирусах, которые содержали фрагменты вируса лихорадки денге и вируса Зика. Согласно результатам, SHERLOCK различал патогены и детектировал их частицы при концентрации не более двух аттомоль. Также метод успешно испытали на сыворотке крови, образцах слюны и мочи с содержанием нуклеиновых кислот порядка трех аттомоль, при этом очистка последних не влияла на чувствительность системы. С помощью искусственных мутаций авторы показали, что SHERLOCK справляется даже с распознаванием однонуклеотидных полиморфизмов (SNP): так, он оказался способен различить четыре человеческих образца по пяти локусам из геномной базы данных. На последнем этапе система справилась с регистрацией 0,1-процентного уровня нуклеиновой кислоты с раковыми мутациями.

 

По мнению исследователей, SHERLOCK может использоваться для генотипирования геномов, мониторинга наследственных заболеваний и патогенных мутаций. Стоимость одного теста с помощью новой техники (на стекловолокнистой бумаге) составит при этом около 61 цента.

 

Статья опубликована в журнале Science.

 

Подробнее о генной инженерии с помощью CRISPR читайте в нашем материале.

Нашли опечатку? Выделите фрагмент и нажмите Ctrl + Enter.
Вчера, 14:34
Илья Ведмеденко

Осведомленный источник ТАСС сообщил, что опытный образец перспективного стратегического бомбардировщика нового поколения соберут к 2023 году. Ранее стало известно, что в России изготовили первый образец двигателя для нового самолета.

Вчера, 11:54
Александр Березин

Среди полностью привитых препаратом от центра «Вектор» процент заболевших Covid-19 слабо отличим от процента заболевших среди тех, кто не прошел вакцинацию. В то же время среди привитых другими вакцинами этот показатель в несколько раз ниже, чем среди непривитых.

11 часов назад
Ольга Иванова

26-летняя девушка из Португалии обнаружила, что после родов у нее началась лактация из подмышечной впадины. Врачи заявили, что это редкий случай полимастии.

1 августа
Мария Азарова

Исследование микробиома кишечника, проведенное японскими и американскими учеными, предоставляет один из потенциальных ключей к долголетию и лечению бактериальных инфекций.

29 июля
Сергей Васильев

В Канаде обнаружили окаменелости, поразительно похожие на скелет морских губок и при этом на миллионы лет старше Кембрийского взрыва, когда появились современные типы животных.

Вчера, 14:34
Илья Ведмеденко

Осведомленный источник ТАСС сообщил, что опытный образец перспективного стратегического бомбардировщика нового поколения соберут к 2023 году. Ранее стало известно, что в России изготовили первый образец двигателя для нового самолета.

25 июля
Александр Березин

До массовой термоядерной энергетики 20 лет — и всегда будет 20 лет. Это незатейливая шутка сама стала старой еще 20 лет назад. Общество расстраивается от того, что термояд все никак не могут вывести на промышленный уровень. И лишь Илон Маск считает, что термоядерный реактор вовсе не нужен. Внимательный анализ показывает, что он прав. Даже если все технические проблемы термоядерной энергетики чудесным образом разрешатся, у нее не будет шансов вытеснить конкурентов. Как так вышло, и что тогда спасет человечество от энергетического кризиса?

13 июля
Ольга Иванова

Международная команда ученых идентифицировала ДНК из почвы в грузинской пещере. Благодаря этому исследователям удалось восстановить геном человека возрастом 25 тысяч лет, не имея никаких скелетных останков.

8 июля
Василий Парфенов

Подросток из бельгийского города Остенде стал вторым самым юным обладателем высшего образования в обозримой истории. Он с отличием окончил курс физики в Антверпенском университете и теперь собирается защитить магистерскую степень, а затем и докторскую диссертацию в этой области. Цель у него простая и понятная: увеличение продолжительности жизни человека вплоть до полного бессмертия за счет замены частей тела и органов механическими или искусственными.

[miniorange_social_login]

Комментарии

Написать комментарий

Подтвердить?
Подтвердить?
Лучшие материалы
Войти
Регистрируясь, вы соглашаетесь с правилами использования сайта и даете согласие на обработку персональных данных.

Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: