14.04.2017
Редакция Naked Science

SHERLOCK отыщет мутации на уровне РНК

Американские ученые разработали быстрый и недорогой метод высокоточной детекции нуклеиновых кислот на основе системы CRISPR-Cas13a.

f9a6efa612edafe4ef363f2248a91ff0
©Wikipedia

Cas13a — бактериальная эндонуклеаза, способная распознавать специфическую последовательность РНК и разрезать схожие нити, расположенные поблизости. Функционально этот фермент аналогичен Cas9, который рассматривается как один из наиболее перспективных способов редактирования генома. По сравнению с последней, Cas13a обладает рядом отличий: во-первых, она вносит в целевую молекулу не разрыв, но полностью уничтожает ее, а во-вторых, работает на уровне РНК (Cas9 рассчитана на ДНК). Эти свойства делают Cas13a неподходящей для геномного редактирования, однако позволяют использовать в иных целях.

 

В новой работе сотрудники Массачусетского технологического института и других учреждений испытали возможности новой системы. Для этого Cas13a патогенной бактерии Leptotrichia shahii инкубировали с репортерной РНК, целевой РНК (ssRNA 1) и CRISPR РНК (crRNA). В кассете последней при этом были закодированы фрагменты ssRNA 1 — она служит для нуклеазы «шпаргалкой» при поиске мишени. Анализ показал, что система хорошо справляется с детекцией in vitro, однако для достижения аттомолярной чувствительности авторам потребовалось подобрать оптимальные условия предварительной амлификации (увеличения нуклеиновых кислот). Нужного уровня точности удалось достичь путем рекомбиназной полимеразной амплификации (увеличения числа копий ДНК).

 

Схема работы SHERLOCK. После конвертации ДНК в РНК в «библиотеке» последней находят мишень с помощью CRISPR-Cas13a, несущей эталон целевой последовательности. Разрушение РНК приводит к флуоресценции / ©Jonathan S. Gootenberg et al., Science, 2017

 

После конвертации ДНК в РНК Cas13a детектировал целевую последовательность, сравнивая ее с закодированной в CRISPR, и разрезал другие РНК. Нуклеаза также уничтожила репортерную РНК — на обнаружение мишени указывала флуоресценция поврежденной молекулы. Методы цифровой капельной полимеразной цепной реакции (ПЦР) — одного из основных способов детекции нуклеиновых кислот — подтвердили, что для работы новой системе необходима только одна молекула ДНК или РНК. При этом, по сравнению с традиционными техниками, она обладает меньшей вариабельностью результатов при многократных повторах.

 

Эффективность системы, получившей название SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing), тестировалась на лентивирусах, которые содержали фрагменты вируса лихорадки денге и вируса Зика. Согласно результатам, SHERLOCK различал патогены и детектировал их частицы при концентрации не более двух аттомоль. Также метод успешно испытали на сыворотке крови, образцах слюны и мочи с содержанием нуклеиновых кислот порядка трех аттомоль, при этом очистка последних не влияла на чувствительность системы. С помощью искусственных мутаций авторы показали, что SHERLOCK справляется даже с распознаванием однонуклеотидных полиморфизмов (SNP): так, он оказался способен различить четыре человеческих образца по пяти локусам из геномной базы данных. На последнем этапе система справилась с регистрацией 0,1-процентного уровня нуклеиновой кислоты с раковыми мутациями.

 

По мнению исследователей, SHERLOCK может использоваться для генотипирования геномов, мониторинга наследственных заболеваний и патогенных мутаций. Стоимость одного теста с помощью новой техники (на стекловолокнистой бумаге) составит при этом около 61 цента.

 

Статья опубликована в журнале Science.

 

Подробнее о генной инженерии с помощью CRISPR читайте в нашем материале.

Нашли опечатку? Выделите фрагмент и нажмите Ctrl + Enter.
5 часов назад
Алиса Гаджиева

Мужчину и женщину похоронили 2500 лет назад и снабдили средством для разговора с Осирисом, необходимыми внутренними органами и большим числом слуг.

Вчера, 13:57
Алиса Гаджиева

Археологи обнаружили, что крупный торговый центр на севере Франции построен на месте некрополя IV века.

Вчера, 13:05
Сколтех

Ученые из Сколтеха и их коллеги изучили генетические характеристики дельта-штамма коронавируса в России. Выяснилось, что всего одна разновидность дельты за короткое время оказалась ответственной за подавляющее большинство случаев заболевания коронавирусом в России — во многих других странах ситуация развивалась иначе. Авторы исследования объясняют доминирование этой разновидности в нашей стране волей случая, а не повышенной заразностью или устойчивостью к иммунитету.

3 декабря
Сергей Васильев

Биологи обнаружили, что обширные скопления пластика позволяют прибрежным животным осваивать открытое море, прежде для них недоступное, и распространяться по всем уголкам океана.

Позавчера, 13:36
Василий Парфенов

Вопрос активности венерианских вулканов занимает планетологов давно. Если они до сих пор извергаются или делали это недавно по геологическим меркам, то недра второй планеты от Солнца по-прежнему активны. Однако получить достоверные данные подтверждающие или опровергающие активность вулканов на Венере до сих пор не получалось. Зато недавно ученые получили еще одно пусть и косвенное, но вполне надежное свидетельство «бурной жизни» геологических формирований на «сестре Земли».

3 декабря
Алиса Гаджиева

У погибшего почти 70 миллионов лет назад хищника была трудная жизнь: помимо обычного набора проблем, таких как схватки с сородичами, он страдал от зубной боли.

12 ноября
Мария Азарова

Кошки оказывались сбиты с толку, когда их человек, как им казалось, «телепортировался» в новое, неожиданное место. Однако они не реагировали таким же образом на чужих людей или других животных.

3 декабря
Сергей Васильев

Биологи обнаружили, что обширные скопления пластика позволяют прибрежным животным осваивать открытое море, прежде для них недоступное, и распространяться по всем уголкам океана.

25 ноября
НИУ ВШЭ

Мобильные ученые публикуются в индексируемых журналах в два раза чаще. К такому выводу пришли исследователи из НИУ ВШЭ.

[miniorange_social_login]

Комментарии

Написать комментарий

Подтвердить?
Подтвердить?
Не получилось опубликовать!

Вы попытались написать запрещенную фразу или вас забанили за частые нарушения.

Понятно
Лучшие материалы
Войти
Регистрируясь, вы соглашаетесь с правилами использования сайта и даете согласие на обработку персональных данных.
Ваша заявка получена

Мы скоро изучим заявку и свяжемся с Вами по указанной почте в случае положительного исхода. Спасибо за интерес к проекту.

Понятно
Ваше сообщение получено

Мы скоро прочитаем его и свяжемся с Вами по указанной почте. Спасибо за интерес к проекту.

Понятно

Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: