Ученые разработали оптимальный метод получения рецептора, необходимого для сердечно-сосудистой системы

❋ 5.1

Эффективная наработка белков — важная задача для современной биотехнологии. Она включает в себя модификацию последовательности белка, выбор клеток для экспрессии, культуральной среды, выбор методов выделения и очистки и т. д. Все этапы можно улучшить, как это продемонстрировали ученые Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ с коллегами на примере рецептора ангиотензина II первого типа (AT1). Белок необходим для работы сердечно-сосудистой системы, поэтому его получают в чистом виде для исследований.

ФизТех

# аминокислоты

# белки

# биохимия

# рецепторы

# сердечно-сосудистая система

Сопряженные с G-белками рецепторы GPCR (G-protein-coupled receptors) — широко представленное у разных организмов семейство мембранных белков. На них действуют множество сигнальных молекул, что позволяет управлять биохимическими и физиологическими процессами. Более того, GPCR являются мишенями большого числа лекарственных препаратов. Все это определяет исключительное значение таких белков для биологии и медицины.

Чтобы использовать GPCR в эксперименте, их необходимо получить в чистом виде. Для этого их экспрессируют в культивируемых клетках, а затем экстрагируют, переводя в растворимую форму и очищая от примесей. Непростая задача, ведь биологические молекулы могут быть нестабильными и разрушаться в неестественных условиях.

Отсюда возникает необходимость оптимизации стандартных протоколов наработки рекомбинантных белков, и GPCR — не исключение. Проблемой занялись исследователи из МФТИ, ОИЯИ (Россия, Дубна) и Чжэцзянского университета (Zhejiang University, Китай). Ученые разработали оптимальную технологию получения рецептора ангиотензина II первого типа АТ1. Он связывает ангиотензин — пептидный гормон, который вызывает сужение сосудов, повышение кровяного давления и высвобождение альдостерона — гормона коры надпочечников. Результаты опубликованы в журнале «Биохимия».

Современные методы исследования требуют выделения больших количеств рецептора AT1 в чистом виде, например чтобы установить структуру белковой молекулы в высоком разрешении с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА). Для этого рецептор необходимо экспрессировать в клеточных культурах. Клетки млекопитающих не годятся для этих целей, поскольку они медленно делятся и не позволяют получить достаточное количество белка. Поэтому ученые МФТИ использовали более подходящую клеточную культуру Sf9, исходно полученную из куколок бабочки Spodoptera frugiperda (кукурузная лиственная совка).

Биофизики отметили, что при экспрессии аминокислотную последовательность AT1 в клетках насекомого следует модифицировать: требуется добавить апоцитохром b562RIL, сократить N-концевой домен и внести ряд мутаций. Эти изменения необходимы, чтобы придать AT1 термостабильность. К тому же белок следует солюбилизировать, то есть перевести в растворимую форму. Рецептор AT1 крайне нестабилен в водных растворах, и это немало осложняет задачу.

Далее исследователи оптимизировали экспрессию AT1 в клетках линии Sf9. Для оценки ее эффективности использовали долю рецептора на мембране клетки, поскольку его направленный перенос туда напрямую связан с правильным сворачиванием белка и посттрансляционными модификациями.

Затем экспрессия рецептора была усилена за счет добавления в среду культивирования его лиганда (кандезартана). Выяснилось, что наработка AT1 в клетках насекомого без этого соединения невозможна. Это связано с нарушением сворачивания белка и его дальнейшего транспорта в клеточную мембрану.

Оптимизация экспрессии AT1. (a) Изменение MOI и времени инкубации во время экспрессии AT1 в отсутствие лиганда. Blanc представлен нетрансфицированными клетками и служит отрицательным контролем; A2a является стабильно экспрессирующим GPCR, служащим положительным контролем экспрессии. Пунктирная линия указывает на уровень поверхностной экспрессии 2%. (b) Изменение концентрации кандесартана от 0,1 до 100 нМ для повышения уровня SE в 2 мл ( вверху ) и 40 мл ( внизу ) культуральной среды. Рецептор A2a использовали в качестве положительного контроля экспрессии. (c) Сравнение влияния кандесартана и лозартана на уровень поверхностной экспрессии путем изменения его концентрации от 0,2 до 120 мкМ в 2 мл культуральной среды. (d) Профили SEC AT1 WT показали, что добавление 1 мкМ кандесартана во время экспрессии значительно улучшило поверхностную экспрессию белка и увеличило мономерную фракцию очищенного белка. SE, поверхностная экспрессия; CV, жизнеспособность клеток. (e) Анализ температурного сдвига очищенного AT1 дикого типа подтвердил функциональность белка. Пунктирные линии обозначают температуру плавления белка. Стандартные ошибки пренебрежимо малы по сравнению с абсолютными значениями, поэтому они не показаны / © «Биохимия»

Для работы с АТ1 в водных растворах особое значение имеет его солюбилизация. В этом случае выход целевого продукта нарастили, подобрав оптимальный детергент (поверхностно-активное вещество), а также определяя его оптимальную концентрацию. Тем не менее ученые подчеркивают, что зависимость эффективности солюбилизации носит сложный характер.

Наконец, работа также подтвердила влияние ионного окружения на выход целевого белка и долей его мономерной формы. А именно увеличение ионной силы повысило концентрацию отдельных рецепторов и сдвинуло отношение мономерных и олигомерных форм AT1 к оптимальной величине.

В результате ученые добились оптимизации процессов экспрессии, экстракции и очистки рецептора AT1. Это позволило увеличить эффективность наработки белка в клетках линии Sf9 и выявить факторы, играющие ключевую роль в стабильности рецептора. Новый подход увеличил содержание AT1 в клетках с нуля до 72%, также повысив общий выход примерно в четыре раза — вплоть до значения 100 микрограмм белка на 100 миллилитров биомассы клеток.

«Наша работа посвящена оптимизации процесса получения мембранного белка АТ1, относящегося к классу рецепторов, сопряженных с G-белком. Этот рецептор играет ключевую роль в регуляции кровяного давления, в контроле выведения из организма воды и ионов в почках. Нарушения, связанные с работой АТ1, приводят к серьезным заболеваниям в первую очередь сердечно-сосудистой системы, поэтому рецептор представляет перспективную мишень для разработки новых лекарств. Мы усовершенствовали протоколы экспрессии белка в клеточной линии Sf9 и его очистки для дальнейших биофизических исследований»,— пояснил Иван Капранов, сотрудник лаборатории структуры и динамики биомолекул Центра исследования молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ.

Нашли опечатку? Выделите фрагмент и нажмите Ctrl + Enter.

Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет), известен также как Физтех — ведущий российский вуз по подготовке специалистов в области теоретической, экспериментальной и прикладной физики, математики, информатики, химии, биологии и смежных дисциплин. Расположен в городе Долгопрудном Московской области, отдельные корпуса и факультеты находятся в Жуковском и в Москве.