Уведомления
Авторизуйтесь или зарегистрируйтесь, чтобы оценивать материалы, создавать записи и писать комментарии.
Авторизуясь, вы соглашаетесь с правилами пользования сайтом и даете согласие на обработку персональных данных.
Исследователи предложили метод быстрого получения белка, играющего важную роль в механизме заражения клетки коронавирусом
Ученые из Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ и Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН с коллегами представили метод получения и очистки трансмембранного домена шиповидного белка коронавируса SARS-CoV-2 (SARStm) дикого типа. Этот «якорь» не только удерживает шип, которым вирус «атакует» клетки, в его оболочке, но и участвует в процессе слияния вирусной и клеточной оболочек. В новом протоколе используется бесклеточная экспрессия — синтез белка в очищенном бактериальном экстракте, что позволяет получать его в течение нескольких часов вместо дней и значительно упрощает очистку. Метод открывает возможность для детального изучения структуры белка с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
Несмотря на то что вирус SARS-CoV-2, вызывающий COVID-19, получил статус наиболее изученного вируса, пока нет полной ясности, как он проникает в клетку-хозяина. Известно, что в процессе заражения активно участвует шиповидный белок коронавируса (спайковый белок), но при этом его трансмембранный домен — фрагмент, пронизывающий оболочку вируса, — остается сравнительно мало изучен.
Изучение ТМД осложняется наличием в его первичной структуре (последовательности аминокислотных остатков, соединённых в цепочку) цистеинов, которые очень любят вступать в реакции. Из-за этого молекулы белка сшиваются друг с другом (образуют дисульфидные мостики) и выпадают в осадок, мешая эксперименту. Раньше эту проблему решали радикально: чтобы избежать слипания, первичную структуру белка намеренно изменяли (вводили мутации). Однако российские ученые из МФТИ с коллегами применили более тонкий подход. Они оставили первичную структуру «дикого типа» (природную), не заменяя цистеины на другие аминокислоты, как делали в других исследованиях. Вместо этого они взяли под контроль химические процессы, «размыкая» лишние связи и сохраняя структуру белка в целости для дальнейших исследований. Исследование опубликовано в журнале Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology.
Для осуществления цели российские ученые применили необычный метод синтеза белка, который вдобавок упростил его очистку. В предыдущих исследованиях белок получали с помощью живых клеток (стандартной бактериальной экспрессионной системы), поэтому приходилось использовать сложные многоступенчатые методы очистки, что могло непосредственно повлиять на то, каким образом белок собирается в тример. Чтобы избежать этого, биофизики из МФТИ с коллегами синтезировали белок SARStm без мутаций методом бесклеточной экспрессии, добавляя генетический материал (плазмиды) непосредственно в готовый экстракт бактерий, содержащий все компоненты для сборки белка. Новый подход позволил получить целевой белок быстрее, чем при производстве живыми клетками, и минимизировать этапы очистки.
Еще один плюс бесклеточной экспрессии — сборка белка напрямую из «изотопно-меченых» аминокислот. Они отличаются тем, что в составе аминокислот обычные атомы углерода и азота (¹²C и ¹⁴N) заменены на более тяжелые изотопы (¹³C и ¹⁵N). Благодаря «лишнему» нейтрону ядра приобретают магнитный момент и становятся «видны» в ходе исследования методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Система меток позволяет восстановить структуру белка с высокой точностью. Чтобы получить меченый белок с помощью живых бактерий, их приходится растить на питательных средах с добавлением изотопно-меченых глюкозы и аммиака, что выходит дороже.
«Главной целью нашей работы было попробовать подобрать условия экспрессии и очистки белка дикого типа, то есть с его природной аминокислотной последовательностью без каких-либо изменений, — объяснила Софья Сударева, младший научный сотрудник лаборатории старения и возрастных нейродегенеративных заболеваний Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ. — Стандартно после экспрессии мы растворяем белок в мицеллах ионного детергента — лауроилсаркозината (LS). Сложность оказалась в том, что в эти мицеллы даже при серьезном нагреве до +95૦С до белка не добирался β-меркаптоэтанол, который должен был разомкнуть цистеиновые мостики, что подняло бы белок из осадка. А помогла долгая выдержка при температуре +4૦С, что довольно неожиданно».
После очистки белка в мицеллах лауроилсаркозината (LS) от примесей ученые специально разрушили эти мицеллы, чтобы освободить и выделить чистый белок. В результате был получен изотопно-меченый белок ¹³C/¹⁵N SARStm высокой чистоты. Его выход составил 0,3 мг из 1 мл реакционной смеси — не максимальное, но достаточное количество для последующего анализа. Затем его переупаковали в новые мицеллы додецилфосфохолина. Эти мицеллы создают внутри себя среду, похожую на жировой слой клеточной мембраны, что позволяет гидрофобному белку принять правильную, рабочую форму и подготовить его для изучения методом ЯМР. ЯМР-анализ очищенного белка подтвердил его пригодность для дальнейших структурных исследований.
Разработанный протокол представляет собой более доступную и быструю альтернативу традиционным методам наработки белка для исследований. Он позволяет не только обойтись без дорогого культивирования бактерий на меченых средах, используя напрямую меченые аминокислоты, но и работать с «капризными» белками. Дальнейшая работа будет направлена на увеличение выхода целевого белка, вычисление его трехмерной структуры и определения механизма проникновения вируса в клетку с помощью этого «якоря».
Telegram 
Дзен 
VK Арахнологи описали новый вид пауков, который копирует облик мертвой особи, пораженной паразитическим грибом, чтобы хищники меньше обращали на него внимание. В природе такой гриб заражает хозяина и воздействует на его нервную систему, после чего заставляет подниматься на возвышенность, откуда легче распространять споры. Открытие расширит представления ученых о мимикрии у животных.
Нанопластика становится все больше в диете среднего человека, но ученые ищут способы не дать ему переместиться из еды в организм навсегда. Оказалось, что источником защиты может стать квашеная капуста.
20 марта Московскому авиационному институту исполняется 96 лет. За эти годы университет прошел большой путь становления, и во многом его развитие определяли люди, посвятившие себя науке и подготовке инженерных кадров. Один из таких — выдающийся ученый, заслуженный работник высшей школы Российской Федерации, доктор технических наук, профессор Борис Семенович Зечихин. Более 70 лет его жизнь неразрывно связана с кафедрой 310 «Электроэнергетические, электромеханические и биотехнические системы» и НИО-310 МАИ. Научная и педагогическая работа Бориса Семеновича получила широкое признание в России и за рубежом, а его вклад в развитие электромеханических специальностей и подготовку инженерных кадров оказал существенное влияние на отечественную авиационную и электротехническую промышленность. Сегодня Борис Семенович продолжает свою работу, участвует в проектах по созданию электрических и гибридных силовых установок, передает опыт и знания молодым специалистам в рамках развития Передовой инженерной школы и всего МАИ в целом.
Археологическая находка, сделанная недалеко от озера Кинерет на территории современного Израиля, показала, что психологическая война на поле боя гораздо древнее, чем можно было бы подумать.
В парках некоторых стран все чаще можно заметить странную картину: синицы и воробьи вместо пуха и веточек приносят в клювах сигаретные окурки. Орнитологи из Польши решили выяснить, зачем птицы выстилают гнезда мусором, пропитанным никотином. Оказалось, пернатые нашли способ использовать вредную человеческую привычку для защиты своего потомства. Но, как это часто бывает в природе, у медали есть обратная сторона.
Арахнологи описали новый вид пауков, который копирует облик мертвой особи, пораженной паразитическим грибом, чтобы хищники меньше обращали на него внимание. В природе такой гриб заражает хозяина и воздействует на его нервную систему, после чего заставляет подниматься на возвышенность, откуда легче распространять споры. Открытие расширит представления ученых о мимикрии у животных.
В парках некоторых стран все чаще можно заметить странную картину: синицы и воробьи вместо пуха и веточек приносят в клювах сигаретные окурки. Орнитологи из Польши решили выяснить, зачем птицы выстилают гнезда мусором, пропитанным никотином. Оказалось, пернатые нашли способ использовать вредную человеческую привычку для защиты своего потомства. Но, как это часто бывает в природе, у медали есть обратная сторона.
Марсоход «Персеверанс» обнаружил в камнях на кромке кратера Езеро спектральные признаки минерала корунда, из которого на Земле образуются рубины и сапфиры. Такие спектры на Красной планете зарегистрировали впервые. Теперь ученые пытаются понять, при каких процессах он мог там сформироваться, ведь условия на Марсе заметно отличаются от тех, в которых корунд обычно образуется на Земле.
За 10 лет лежания в почве сигаретные фильтры не растворились, а лишь замаскировались под грязь. Их пластиковые волокна распались на микрочастицы, намертво склеились с минералами и превратились во вторичный микропластик. Более того, на пятом году гниения мусор начал отравлять землю с новой силой.
Вы попытались написать запрещенную фразу или вас забанили за частые нарушения.
Понятно
Из-за нарушений правил сайта на ваш аккаунт были наложены ограничения. Если это ошибка, напишите нам.
Понятно
Наши фильтры обнаружили в ваших действиях признаки накрутки. Отдохните немного и вернитесь к нам позже.
Понятно
Мы скоро изучим заявку и свяжемся с Вами по указанной почте в случае положительного исхода. Спасибо за интерес к проекту.
Понятно