Когда оптические микроскопы стали давать достаточное увеличение, чтобы в них были видны отдельные клетки, исследователи столкнулись с проблемой низкой контрастности. Клетки животных и растений в основном прозрачны для видимого света. Маленькие клеточные структуры, ядра и митохондрии, рассеивают небольшое количество света, что делает их лишь немного темнее остального содержимого клетки. Этот низкий контраст обычно улучшают предварительным окрашиванием биологического материала, хотя оно сильно меняет клетку.
Проблему низкого контраста решил Фриц Цернике, предложив фазовую пластину, за что получил Нобелевскую премию. Он понял, что свет, рассеиваясь на клетке, не только теряет яркость (амплитуду), но и замедляется, меняется его фаза. Человеческому глазу фазовый сдвиг невидим, но можно заставить его проявиться, если сдвинуть фазу нерассеянного света на 90 градусов.
Когда рассеянный и нерассеянный свет фокусируются на сетчатке и взаимодействуют, световые волны усиливают или гасят друг друга. Так детали образца становятся видны лучше, повышается контрастность. Чтобы использовать этот эффект, ученый добавил в микроскоп фазовую пластину. Эта деталь поворачивает фазу света, прошедшего через образец без рассеяния.
Сейчас биологи используют уже электронные микроскопы для исследования мелких структур внутри клетки. Этот прибор направляет на образец не фотоны, а электроны. Но и в этой микроскопии проявилась проблема контраста. Причем сделать для электронного микроскопа аналог фазовой пластины долго не получалось — когда экспериментаторы меняли фазу электронного пучка, то попутно слишком сильно уменьшали его интенсивность, делали изображения нестабильными или снижали его разрешение.
Физики Калифорнийского университета в Беркли (США) нашли способ повысить контраст изображений настолько, что стали четко видны небольшие человеческие белки, такие как гемоглобин. Для этого потребовалось больше 10 лет исследований и мощный лазер с высокой точностью фокусировки. Статья о разработке опубликована в журнале Science.
Ученые сосредоточились на криоэлектронной микроскопии и криоэлектронной томографии — методах, работающих при высоком увеличении для сильно охлажденного образца. Большинство белков человека и животных без усиления контраста слишком малы для анализа этими методами.
Чтобы решить проблему, физики добавили на место пластины лазерное излучение. Они сфокусировали непрерывный луч лазера в пятно размером несколько микрон и мощностью 75 киловатт. В точке пересечения с пучком электронов лазерное излучение сдвигает фазу на 90 градусов благодаря накопленной энергии.
В статье исследователи показали восстановленные изображения фермента альдолазы, который относительно легко визуализировать, и гемоглобина — белка, переносящего кислород в крови, — который виден на пределе возможностей современных приборов. Лазерная фазовая пластина улучшила разрешение структуры белка в обоих случаях, но особенно для меньшей молекулы — гемоглобина.
Молекулярную массу белка измеряют в дальтонах. Современная криоэлектронная микроскопия с трудом визуализирует белки меньше 70 килодальтон, а они составляют около 90 процентов от всех белков организма человека. Авторы статьи считают, что с лазерной фазовой пластиной стало возможно рассматривать белки размером до 50 килодальтон, а это уже половина белков человека. Они надеются довести разрешение до размеров миоглобина — около 17 килодальтон.
«Это дополнение к криоэлектронной микроскопии может заполнить огромный пробел в наших знаниях о структурах белков, которые невозможно кристаллизовать или которые слишком малы для современного состояния техники. А для криоэлектронной томографии это будет революцией», — рассказал Хольгер Мюллер (Holger Müller), профессор физики Калифорнийского университета в Беркли (США), который руководил разработкой.
Исследователи считают, что такая точность может качественно изменить наше понимание механизмов возникновения и протекания болезней.