Российские ученые разработали метод, который в режиме реального времени выявляет нарушения метаболизма нервных клеток, возникающие при серьезных генетических и нейродегенеративных заболеваниях, таких как синдром Дауна, болезни Альцгеймера и Паркинсона. Для этого биологи измерили свечение вещества, участвующего в метаболических процессах клеток. Сами клетки выращивали в виде шаров-сфероидов — так условия наиболее близки к природным. Разработка поможет при проверке эффективности новых лекарств и диагностике заболеваний.
Флуоресценция связанной формы НАД(Ф)Н в клетках с дополнительной 21-й хромосомой (а) и в здоровых клетках (b) / ©Kashirina et al. / Biomedicines 2021
Результаты исследования, поддержанного грантом Президентской программы Российского научного фонда (РНФ), опубликованы в журнале Biomedicines. Нейродегенеративные и некоторые наследственные заболевания, например синдром Дауна, вызывают многочисленные «поломки» в клетках нервной ткани, что негативно сказывается на работе головного мозга. Одно из таких нарушений связано с тем, что митохондрии — энергетические станции клетки — начинают медленнее окислять органические вещества, из-за чего клетка получает меньше энергии.
Это может привести к неправильному развитию нейронов и снижению их активности. Поэтому для диагностики заболеваний и при тестировании лекарств, замедляющих их прогрессирование, ученые отслеживают процессы, которые протекают в митохондриях. Все существующие для этого методы основаны на введении в клетки красящих веществ, которые часто имеют токсический эффект и поэтому небезопасны для живых организмов.
Ученые из Приволжского исследовательского медицинского университета (Нижний Новгород), Первого Московского государственного медицинского университета имени И. М. Сеченова (Москва), Института биологии развития имени Н. К. Кольцова РАН (Москва), Центра высокоточного редактирования генома и генетических технологий для биомедицины Российского национального исследовательского медицинского университета имени Н. И. Пирогова (Москва), Нижегородского государственного университета имени Н. И. Лобачевского (Нижний Новгород) и Московского физико-технического института (Москва) разработали новый безопасный метод, который позволяет в режиме реального времени отслеживать изменения метаболизма нервных клеток.
Исследование проводили на сфероидах — нейральных стволовых клетках, выращенных методом висящей капли. Подход заключается в том, что питательная среда, в которой находятся клетки, свисает под действием силы тяжести с твердой поверхности, например стекла, тем самым создавая условия, наиболее близкие к организму человека. Биологи исследовали два типа нейронов: здоровые и имеющие дополнительную 21-ю хромосому, то есть с набором, характерным для синдрома Дауна.
Активность окислительных процессов в митохондриях оценивали по количеству молекул НАД(Ф)Н. Это соединение существует в клетке в двух состояниях: свободном и связанном с ферментом, который осуществляет окисление. Когда митохондрии активно функционируют и вырабатывают много энергии, большая часть НАД(Ф)Н находится в связанном состоянии. Известно, что эти молекулы флуоресцируют, то есть при возбуждении светом определенной длины волны начинают светиться. При этом свободный НАД(Ф)Н обладает более низкими характеристиками флуоресценции, чем связанный, благодаря чему состояния молекулы можно различить.
Другим признаком, по которому ученые оценивали метаболические процессы в нейронах, была кислотность среды (рН). В норме ее значение близко к нейтральному (7,0), а если в клетке окислительно-восстановительные реакции протекают с нарушениями, этот показатель изменяется в меньшую (кислую) или большую (щелочную) сторону. Значения рН биологи определяли, измеряя уровень флуоресценции встроенного в нервные клетки белка, чувствительного к кислотности цитоплазмы. Его флуоресценция, как и у НАД(Ф)Н, изменяется в зависимости от условий.
Флуоресценцию НАД(Ф)Н и белка-детектора ученые вызывали под микроскопом лазерным лучом. На этом же приборе улавливали интенсивность ответного свечения. Такой метод позволил определить, что в нейральных стволовых клетках с дополнительной хромосомой НАД(Ф)Н находится преимущественно в свободном состоянии, что свидетельствует о том, что окислительные реакции в митохондриях нарушаются, а значит, клетки не получают необходимого количества энергии. Кроме того, оказалось, что в цитоплазме более высокие значения рН, то есть слабощелочная среда, которая также указывает на нарушение метаболизма.
«С помощью сфероидов — модели, максимально приближенной к условиям in vivo, — мы предложили простой, высокочувствительный и неинвазивный метод, который позволяет оценить метаболизм нервных клеток в режиме реального времени. Он поможет при разработке новых подходов к лечению генетических и нейродегенеративных заболеваний, а также оценке эффективности различных лекарств», — рассказала руководитель проекта по гранту РНФ Александра Кашина, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией регенеративной медицины ПИМУ.
