Флуоресцентные белки — важный инструмент современных биологов. Среди них выделяются те, что светятся в инфракрасном диапазоне, например iRFP713, полученный на основе бактериофитохрома из бактерии Rhodopseudomonas palustris. В новой статье ученых МФТИ и Института цитологии РАН (Санкт-Петербург) описана мутантная форма белка iRFP713/C15S/V254С. Показано, что его флуоресценция станет вчетверо выше, если использовать белок в комплексе с фикоцианобилином вместо биливердина. Результат опубликован в The FEBS Journal.
Начало использования флуоресцентных белков резко увеличило возможности биологов. За «флуоресцентную революцию» в науке о жизни следует поблагодарить зеленый флуоресцентный белок GFP (green fluorescent protein), впервые выделенный из медузы Aequorea victoria. В природе он помогает морскому животному светиться, а в лабораториях по всему миру стал инструментом для визуализации клеточных процессов.
GFP, RFP (red fluorescent protein) и множество их родственников с мутациями помогли резко увеличить разрешающую способность микроскопов, изучать взаимодействия молекул, их транспорт и многое другое. Чтобы отличать флуоресценцию отдельных белковых меток при совместном использовании, необходимо различие в их спектрах флуоресценции. Проще говоря, разные цвета. Фиолетовое свечение соответствует минимальной длине волны в видимой части спектра, за ним идут синее, зеленое, желтое, оранжевое и красное.
Однако белки могут излучать и в ближнем инфракрасном спектре. Такие белки (iRFP) имеют важные преимущества. Их свечение приходится на «окно прозрачности» биологических тканей — излучение, которое не задерживают ни черный пигмент меланин, ни гемоглобин крови. Благодаря этому такие метки можно увидеть и в глубине тканей, например — в мозге живой лабораторной мыши.
Такие инфракрасные биомаркеры получены на основе белка из бактерии Rhodopseudomonas palustris RpBphP2, которая широко распространена и способна «переключать» свой метаболизм, в том числе переходя к фотосинтезу. Он имеет специальный домен, связывающий хромофор, — небольшую флуоресцирующую молекулу. Например, фикоцианобилин или биливердин, соединения из группы тетрапирролов, имеющих четыре кольца. Тетрапирролы могут ковалентно связываться с остатком цистеина белка в положении 15, на его N-концевой части, а также с другим цистеином в положении 254.
Remeeva, A. A. et al., The FEBS Journal
Один из наиболее популярных iRFP — iRFP713 — оказывается более ярким в комплексе с фикоцианобилином, но предпочитает связываться с биливердином. Это может помешать исследованию клеток человека и других млекопитающих, поскольку они содержат собственный биливердин (зеленый пигмент, образующийся в печени, селезенке и костном мозге при распаде гемоглобина).
Поэтому авторы нового исследования использовали мутантную версию белка iRFP713 — iRFP713/C15S/V254C, которая благодаря мутациям C15S (замена цистеина в положении 15 на серин) и V254C (цистеин вместо валина в положении 254) более предпочтительно связывает фикоцианобилин.
Ученые экспрессировали iRFP713/C15S/V254С в клетках линии HEK293T, полученных из эпителия почки человека. Они использовали конфокальную микроскопию, чтобы описать образование комплекса этого белка с фикоцианобилином внутри клеток. Проточная цитофлуориметрия оценила эффективность флуоресценции комплекса: она оказалась в четыре раза выше, чем в случае связывания того же белка с биливердином.
Несмотря на схожую структуру фикоцианобилина и биливердина, их способность к флуоресценции различна. Однако причина этого не до конца ясна.
Поэтому в статье также исследованы структурные основы связывания iRFP с фикоцианобилином. Для этого ученые кристаллизовали комплекс двух молекул и установили его устройство с высоким разрешением с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА). Белок iRFP образует комплексы из отдельных белков — олигомеры. Ориентация молекул внутри них может быть противоположной: как параллельной, так и антипараллельной.
Remeeva, A. A. et al., The FEBS Journal
Далее использовали компьютерное моделирование, а именно: методы молекулярной динамики. Они показали, что подвижность белка и хромофора относительно друг друга примерно одинакова при разных способах связывания и мало меняется при замене фикоцианобилина на биливердин.
Оказалось, что плоская молекула биливердина стабилизирована системой ветвистых сопряженных пи-связей и более склонна терять энергию за счет движения, а не флуоресценции. Это определяет больший выход флуоресценции комплекса с фикоцианобилином.
Ученые пришли к выводу, что фикоцианобилин — перспективный хромофор для разработки новых флуоресцентных биомаркеров на основе бактериальных фитохромов.
«Наблюдение за биологическими процессами на молекулярном уровне лежит в основе практически всей современной биологии, поэтому разработка улучшенных инструментов для микроскопии — важнейшая задача. Мы расшифровали структуру флуоресцентного белка iRFP713, светящегося в ближне-инфракрасной области спектра, и изучили его динамику, а коллеги из Санкт-Петербурга показали, что изучавшийся вариант (в комплексе с фикоцианобилином) обладает уникальной яркостью при применении в клетках человека. Благодаря новым данным стало понятнее, почему белок столь эффективен, и появилась возможность для рационального дизайна улучшенных вариантов»,— поделился руководитель работы Иван Гущин, заведующий лабораторией структурного анализа и инжиниринга мембранных систем МФТИ.