Черепно-лицевые аномалии — одни из наиболее частых врожденных дефектов во всем мире. В качестве причин называют вещества в лекарствах, предметах домашнего обихода и окружающей среде. Как оказалось, они влияют на развитие эмбрионов рыбок данио-рерио. По словам ученых, это поможет понять, как происходит внутриутробное развитие черт лица человека.
Генетически модифицированный эмбрион рыбки. Обычно они прозрачные, но в этом случае костеобразующие клетки на лице излучают зеленую флуоресценцию / © University of Tokyo
Черепно-лицевые аномалии составляют более трети всех врожденных дефектов. Более 700 нарушений связаны с черепно-лицевыми особенностями: в пример можно привести расщелину губы («заячья губа») и неба («волчья пасть»). Точная причина черепно-лицевых различий до конца не изучена, но исследователи полагают, что здесь могут быть задействованы несколько факторов: генетика, экология, образ жизни родителей, некоторые заболевания, лекарства или химические вещества.
Последние два называют тератогенами. Это вещества, которые нарушают рост эмбриона или плода. Потенциальные тератогены обычно проверяют на грызунах и кроликах. Однако в последнее время растущее количество производимых химических веществ требует их анализа и оценки с высокой производительностью и большей точностью. Кроме того, исследователи ищут альтернативные методы, которые быстрее, дешевле и уменьшают необходимость тестирования на млекопитающих.
На помощь пришли рыбы данио-рерио. Их эмбрионы прозрачные, растут быстро, развиваются вне тела родителя, что делает их идеальными для изучения раннего развития. За последние 10 лет несколько исследовательских проектов показали, что рыбок можно эффективно использовать для проверки на наличие тератогенов. Однако точные механизмы, с помощью которых тератогены нарушают или изменяют типичное эмбриональное развитие, все еще изучаются.
Сейчас команда ученых Токийского университета сосредоточилась на конкретном генетическом маркере группы клеток, участвующих в черепно-лицевом развитии у млекопитающих и у рыб. Известно, что у людей они становятся частями носа и челюсти. Исследование опубликовано в журнале Toxicological Sciences.
Взрослых самцов и самок данио-рерио (через 4-10 месяцев после оплодотворения) помещали в резервуар для размножения с сепаратором ближе к вечеру за день до нереста. Утром сепаратор снимали, а нерест стимулировали при включении света. Оплодотворенные икринки собирали в течение одного часа после снятия сепаратора. Яйца инкубировали в среде E3 при 28 °C и подвергали воздействию тестируемых соединений через четыре часа после оплодотворения. Экспозиционную среду заменяли ежедневно, а образцы собирали на стадии пять-шесть сомитов до 96 часов после оплодотворения.
Ученые разработали серию трансгенных линий рыбок: sox10:EGFP, sox10:EGFP-CAAX и sox10:Dendra2, которые визуализируют клетки нервного гребня. В этих линиях флуоресценция разграничивает клетки краниального нервного гребня, которые мигрируют из нервной трубки по стереотипному пути, образуя первую глоточную дугу, и дифференцируются в черепно-лицевые хрящи, такие как решетчатая пластинка (небо рыбы), верхняя часть глоточной дуги и нижней челюсти. Они вводили трансгенным эмбрионам тератогены.
«Мы манипулировали геномом эмбрионов рыбок данио-рерио и сделали костеобразующие клетки флуоресцентно видимыми в зеленом цвете. Затем мы обрабатывали их химическими веществами, которые, как известно, вызывают дефекты лица у новорожденных людей, и отслеживали траектории костеобразующих клеток на эмбриональных стадиях», — объяснили ученые.
Всего протестировали пять химических веществ: вальпроевую кислоту (используется для лечения неврологических и психических расстройств), варфарин (антикоагулянт), салициловую кислоту (применяется для лечения кожных заболеваний), кофеин и метотрексат (используется в химиотерапии). Как и ожидалось, все протестированные химические вещества вызвали различные степени черепно-лицевых аномалий через 96 часов после оплодотворения. Однако ученых удивил сам механизм действия и короткие сроки.
«Клетки, образующие кости и хрящи в голове, называемые краниальными клетками нервного гребня, обычно перемещаются на большое расстояние от места, где они впервые сформировались в задней части шеи, к местам назначения, таким как челюсть или нос. Мы были удивлены тем, что независимо от того, как каждое химическое вещество действует на клетки на молекулярном уровне, нарушение миграции костеобразующих клеток на раннем этапе развития было ответственным за возникновение пороков развития лица для всех пяти химических веществ. Мы смогли увидеть признаки этого всего за 24 часа, когда эмбрионы рыб и млекопитающих имеют очень схожие морфологические и молекулярные характеристики», — отметили специалисты.
По их словам, результаты работы указывают на потенциальное существование общего механизма, с помощью которого тератогенные химические вещества ограничивают движение клеток нервного гребня на ранних стадиях развития эмбрионов, вызывая развитие лицевых различий. Предполагается, что различия, вызванные другими веществами, могут происходить по тому же механизму.
Ученые будут стремиться раскрыть молекулярный механизм, лежащий в основе нарушения миграции клеток, чтобы понять, почему различные химические вещества приводят к общим дефектам миграции клеток. Они также предложили рыбок данио-рерио в качестве модельного животного, на котором можно выявлять, насколько то или иное вещество опасно как межвидовой тератоген. Это упростит и родителям, и практикующим врачам понимание опасности, исходящей от тех или иных соединений.
