Ученые разработали новую технологию быстрого анализа бактериальных белков, позволяющую с точностью до 95 процентов определить состав и жизнеспособность микробиологического образца. При этом даже в сложных смесях почвенных микроорганизмов ошибки при определении бактерий на уровне рода не превышали 12 процентов. Кроме того, разработанный подход позволил отслеживать изменения в метаболизме (обмене веществ) бактерий. Методика может использоваться в медицине для диагностики заболеваний, а также для исследования микробных сообществ в целях экологического мониторинга.
Схема эксперимента / © Ирина Тарасова, пресс-служба РНФ
Результаты исследования, поддержанного грантом Российского научного фонда (РНФ), опубликованы в Microchemical Journal. Микробы играют огромную роль в нашей жизни. Они живут в нашем организме, на поверхности кожи, вокруг нас, формируя сложные сообщества, влияющие на наше здоровье и окружающую среду. Изучение этих микроскопических экосистем — сложная задача, поскольку микробы очень разнообразны, а их активность меняется в зависимости от условий окружающей среды.
На сегодняшний день активность микроорганизмов ученые могут оценить с помощью нескольких методов масс-спектрометрии, которые требуют большого количества времени и усилий. Так, с помощью протеомного анализа bottom up и на основе тандемной масс-спектроскопии исследователи анализируют образцы бактериальных белков, при этом их приходится предварительно «разрезать» ферментами на небольшие пептиды, а в случае масс-спектрометрии затем еще дополнительно фрагментировать.
Другой метод, на основе времяпролетной масс-спектрометрии, хотя и позволяет быстро определить, какой вид микробов присутствует в образце, ничего не скажет о состоянии этих микробов: их активности, обмене веществ и так далее. Поэтому нужны новые инструменты, которые позволят не только быстро идентифицировать микроорганизмы, но и оценивать их функциональную активность. Это важно для борьбы с болезнями, защиты окружающей среды и создания новых биомедицинских технологий.
Ученые из Федерального исследовательского центра химической физики имени Н.Н. Семенова РАН (Москва) с коллегами разработали новый метод под названием DirectMS1, позволяющий быстро оценить как видовой состав, так и функциональную активность микроорганизмов и их сообществ. Авторы упростили и на порядок ускорили сбор экспериментальных данных, отказавшись от фрагментации белков и сократив часовой эксперимент до семи минут.
Исследователи протестировали метод на отдельных популяциях микроорганизмов, модельных микробных сообществах с известным составом и доступных экспериментальных данных о микробиоте кишечника человека. Так, в рамках подхода экспериментальные данные — последовательности белков бактерий в образце — сопоставлялись с базой данных бактериальных белков, известных на данный момент. Чтобы сократить время анализа, ученые разделили процесс определения бактериальных видов на два этапа: сначала проводили предварительный поиск, сократив таким образом базу данных до наиболее вероятных бактерий, а затем использовали ее для точного определения видов.
Исследователи проверили эффективность такого двухэтапного подхода. Для этого ученые с помощью разработанного метода проанализировали белки 19 заранее известных штаммов бактерий. Оказалось, что двухэтапный алгоритм определяет виды микроорганизмов с точностью 95 процентов.
Кроме того, авторы оценили, сможет ли двухэтапный поиск выделить разные микроорганизмы в смеси почвенных бактерий. В этом случае при определении рода точность метода составила 88 процентов.
Предложенный подход также позволил описать изменения в метаболизме (обмене веществ) бактерий, которые происходят под влиянием среды обитания. Так, ученые проверили, как меняется биохимическая активность двух видов актинобактерий рода Rhodococcus, расщепляющих ароматические углеводороды и, следовательно, перспективных для утилизации токсичных отходов нефтеперерабатывающей промышленности. В окружении вредных веществ бактерии активно синтезировали набор белков-ферментов, участвующих в их разложении. По количеству таких соединений можно быстро оценивать эффективность и жизнеспособность исследованных бактерий.
«Наш подход позволяет проводить быстрый и информативный анализ отдельных микроорганизмов и микробных сообществ. Эту технологию можно применять к любым бактериям и грибам. Она упростит оценку активности микроорганизмов, в том числе патогенных, определение состава и функционального состояния микробиоты для клинической диагностики и экологического мониторинга. В настоящее время совместно с коллегами из Сколтеха, МФТИ и ИОГен РАН мы тестируем наш метод на микробных сообществах почв, микробиоты кишечника сельскохозяйственной птицы и животных моделях болезни Паркинсона.
Мы уверены, что в скором времени сможем предложить микробиологам готовое технологическое решение, которое значительно ускорит функциональный анализ микробиоты и повысит его доступность», — рассказывает участник проекта, поддержанного грантом РНФ, Ирина Тарасова, кандидат физико-математических наук, ведущий научный сотрудник Федерального исследовательского центра химической физики имени Н.Н. Семенова РАН.
В исследовании также приняли участие сотрудники Пущинского научного центра биологических исследований РАН (Пущино), Белгородского государственного национального исследовательского университета (Белгород) и Университета Южной Дании (Дания).
