Биомолекулы, находящиеся в малоисследованных животных, растениях и грибах все чаще становятся прототипами перспективных лекарственных средств. Среди них выделяются яды пауков — настоящая природная библиотека биологически активных молекул, способных точечно воздействовать на нервную и другие системы нашего организма. Среди множества паучьих токсинов выделяется группа ноттинов. Это небольшие пептиды длиной 20–50 аминокислотных остатков с очень стабильной структурой, которые избирательно меняют работу клеточных мембран и рецепторов.
Ноттины обладают высокой устойчивостью — их сложно разрушить нагреванием или химическим воздействием. Они также защищены от расщепления: большинство обычных белков быстро распадаются в нашем организме под действием ферментов. Ноттины же к ним невосприимчивы, что позволяет таким пептидам долго циркулировать в крови и оказывать биологическое действие. В новой работе изучен их представитель, паучий токсин ProTx-I.
Это вещество и близкие ему соединения часто рассматривают в качестве модели для создания анальгетиков нового поколения. Дело в том, что они действуют на ионные каналы, которые участвуют в восприятии и распространении болевых сигналов (NaV1.7, NaV1.8, TRPA1). Проведя структурные и функциональные исследования взаимодействия таких токсинов и каналов-мишеней, можно с помощью рационального дизайна создавать новые препараты для терапии боли и неврологических воспалительных синдромов.
По своей химической природе ProTx-I представляет собой небольшой белок (пептид) из 35 аминокислотных остатков. Молекулу стабилизируют дисульфидные мостики — связи между содержащими серу аминокислотами. Они формируют особый мотив, так называемый ингибиторный цистиновый узел. Подобную структуру затруднительно получить при искусственной наработке токсина с помощью микроорганизмов. Но это необходимо для изучения свойств молекулы. Биотехнологические методы получения также потребуются для производства в промышленных масштабах, если на основе ProTx-I будет создано новое лекарственное средство.
Этим практически значимым вопросом занялись ученые из ИБХ РАН, МФТИ, МГУ им. М. В. Ломоносова и Шэньчжэньского МГУ-ППИ Университета (Китай). Они сравнили разные способы получения ProTx-I с помощью трансгенных бактерий E. coli. Исследователи попытались синтезировать пептид в цитоплазме бактерии в составе слитых белков с тиоредоксином и глутатион-S-трансферазой, однако при таком подходе наблюдалось нарушение пространственной структуры ProTx-I. Результаты опубликованы в Acta Naturae. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда.
Потребовались альтернативные подходы, которые и привели к успеху. Первый — прямая экспрессия белка в цитоплазме, но не в растворимом виде, а в составе телец включения. Так называют крупные нерастворимые агрегаты из молекул, которые появляются в бактериях при экспрессии чужеродных (рекомбинантных) белков. Однако в этом случае белковые молекулы требуется сначала «привести в порядок» — ренатурировать, чтобы придать нужную конформацию.
Другой успешный метод — секреция ProTx-I, слитого с белком, связывающим мальтозу, в периплазматическое пространство бактерии. Это «внешний отсек» у грамотрицательных бактерий, который находится между двумя их мембранами — цитоплазматической и внешней.
Далее активность полученного ProTx-I изучали с помощью ооцитов шпорцевой лягушки Xenopus laevis — модельных клеток, широко используемых для электрофизиологических исследований. Они позволяют понять состояние ионных каналов и рецепторов на мембране, которое легко заметить по изменениям проходящего через нее тока. В ооциты ввели гены, кодирующие каналы TRPA1 человека и крысы. Это хемочувствительный канал (отвечает на химические сигналы), который служит важной мишенью для таргетированной терапии болевых и неврологических воспалительных синдромов.
Оказалось, что чувствительность человеческих рецепторов к токсину в три раза ниже, чем у крыс. А в проведенных ранее исследованиях TRPA1 каналы мыши отвечали на ProTx-I слабее, чем человеческие каналы. Ученые считают, что различия в действии токсина на рецепторы из разных организмов связаны с заметными изменениями в аминокислотной последовательности внеклеточных петель канала TRPA1 (S1-S2 и S3-S4), которые являются основным сайтом связывания ProTx-I. Кроме того, выяснилось, что добавление всего одной лишней аминокислоты (метионин) в N-концевую последовательность белка значительно снижает активность токсина паука.
«Мы разработали эффективную систему бактериальной продукции токсина ProTx-I, и это открывает широкие перспективы для изучения того, как токсин влияет на функционирование канала. Например, полученные образцы сразу помогли нам выявить интересные особенности токсина. Изучая его влияние на ионные токи через мембраны ооцитов Xenopus, экспрессирующих каналы TRPA1 крысы и человека, мы выявили критическую роль N-концевого участка для функциональности токсина», — подчеркнула Екатерина Люкманова, профессор кафедры физико-химической биологии и биотехнологии Физтех-школы биологической и медицинской физики МФТИ.