Ученые из Долгопрудного, Красноярска и Дубны предприняли попытку разобраться в механизме свечения белка гидромедузы (фотопротеина), который широко используется при проведении биомедицинских анализов. Для этого были исследованы фотопротеины с мутациями, затрагивающими ключевые участки белковой молекулы. Мутантные белки не потеряли способности к биолюминесценции, однако изменили продолжительность и яркость свечения.
Один из этапов подготовки мутантной версии фотопротеина обелина для экспериментального анализа. После добавления раствора хлорида кальция наблюдается длительное свечение / © Павел Наташин
Опубликованные в журнале International Journal of Molecular Sciences результаты могут быть полезны для конструирования новых вариантов фотопротеинов с желаемыми характеристиками биолюминесценции.
Светящиеся белки-фотопротеины из медузы Aequorea victoria и гидроида Obelia longissima — «рабочие лошадки» биотехнологов. Ключевой их особенностью является способность светиться голубым светом при взаимодействии с кальцием. После того как в 1990-х годах были обнаружены гены, ответственные за производство акворина и обелина, их использование в генной инженерии в качестве молекулярных светящихся сенсоров возрастало с каждым годом.
Поскольку реакция свечения фотопротеинов запускается повышением концентрации ионов кальция в цитоплазме, это может служить инструментом для исследования процессов клеточного деления, мышечных сокращений, передачи нервных импульсов, а также клеточной секреции. Фотопротеины, гены которых встраивались в различные организмы: от бактерий E. coli до млекопитающих, теперь помогают в изучении разнообразных событий, происходящих внутри клеток.
Тем не менее до сих пор не вполне ясна последовательность промежуточных стадий превращения субстрата фотопротеина в продукт реакции. Этот процесс превращения и лежит в основе реакции биолюминесценции. Чтобы его понять, ученым необходимо знать строение активного центра белка. Так, в предыдущей работе, посвященной обелину, биофизики из МФТИ и Института Биофизики СО РАН с коллегами исследовали особенности его свечения в комплексе с химически измененным искусственным субстратом фотопротеина. Продолжая исследования, ученые решили на этот раз перестроить активный центр самого белка. Для этого с помощью генной инженерии была произведена замена нескольких нуклеотидов в гене фотопротеина, встроенного в E. coli.
«Мы использовали кишечную палочку для производства “мутантных” версий акворина и обелина. Так нам удалось получить фотопротеины, в активном центре которых не присутствует молекула воды. Наличие молекулы воды считается критически важным для протекания реакции, — поясняет Павел Наташин, кандидат биологических наук научный сотрудник лаборатории фотобиологии Института биофизики КНЦ СО РАН. — Оказалось, что реакция все-таки протекает, но при этом меняется интенсивность свечения и его продолжительность — вместо вспышки наблюдалось длительное свечение. Наша основная цель — научиться конструировать биолюминесцентные белки с заданными свойствами, чтобы иметь необходимый инструмент для каждой экспериментальной задачи. Например, интересно получить фотопротеин, светящийся красным светом, так как этот свет хорошо проходит через через живые ткани лабораторных животных».
«Рациональное проектирование — это один из методов в инженерии белков, когда ученые пытаются создавать белки с улучшенными свойствами, основываясь на их трехмерной структуре и взаимосвязи между структурой и функцией. Проделанная нами работа как раз позволяет увидеть такую взаимосвязь и более осмысленно подходить к задачам создания белков с желаемыми характеристиками», — заключает Валентин Борщевский, заместитель директора Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ.
