О биологически активных веществах растительного происхождения слышали многие. А вот о защитных пептидах растений, значение которых в свете распространения инфекционных болезней сложно переоценить, нет. В материале ТюмГУ — о перспективах антимикробных пептидов в сельском хозяйстве.
Гниль на помидорах / ©sad24.ru
Миллионы жизней, унесенные эпидемией чумы в средневековой Европе, сегодняшнему читателю покажутся пережитком эпохи до открытия антибиотиков. Высокая плотность населения в городах уже давно не является главной причиной вспышек инфекционных заболеваний. Однако новые вирусы появляются регулярно и продолжают нас пугать.
Сегодня даже школьник знает, что вакцина против гриппа помогает иммунитету обхитрить постоянно мутирущий вирус. Вот почему ученые работают над новыми вакцинами: эволюционная гонка «жертва-паразит» не прекращается ни на минуту. Но являются ли мутационные соревнования вирусов человека единственным призраком «черной чумы» в современном мире?
Защитная система растений – фитоиммунитет – также постоянно соревнуется в эффективности своего оружия с многочисленными фитопатогенами (грибами, бактериями, микоплазмами, вирусами и вироидами). Создание человеком так называемой монокультуры, единственного возделываемого на конкретной пашне вида растения, существенно усложняет задачу фитоиммунитета. Способен ли человек защитить культурные растения от массовых заболеваний – эпифитотий – и обеспечить себе продовольственную безопасность?
Так же как иммунная система некоторых людей ослаблена сегодня неумеренным приемом антибиотиков, защитная система культивируемых растений работает в упрощенном режиме. Другими словами, дикие предки культивируемой сегодня пшеницы, производят более широкий спектр биологически активных веществ, что позволяет им эффективно бороться с вредителями (рисунок1).
Сегодня генетики и биохимики изучают это явление, чтобы понять, какие гены «замолчали» или мутировали в процессе селекции культурных видов, а также, чтобы найти ту «золотую пулю», которая поможет увеличить устойчивость растений к болезням.
Предполагается, что в процессе эволюции в результате мутаций, растения получали способность синтезировать токсичные для насекомых и травоядных животных вещества, в том числе подавляющие рост патогенных микробов. Такие мутации, сохраняясь из поколения в поколение, давали преимущество в выживании, закреплялись и становились неотъемлемой частью генома растения.
Неотъемлемой до тех пор, пока такие генетические конструкции не утрачивались в процессе селекции пищевых растений человеком, который культивировал их с ядовитыми горечами и резкими запахами только в аптекарских огородах. Тогда человек вернулся к исходной точке: сегодня средствами для борьбы с вредителями растений часто служат вещества растительного же происхождения. Например, синтетические пиретроиды – аналоги низкомолекулярных вторичных метаболитов – пиретринов из далматской ромашки. Откуда в ромашке появились пиретрины? Вероятно, выработались в процессе эволюции для защиты от вредителей.
Так что же, получается, что культурные растения полностью утратили способность к самозащите? Конечно, нет, ведь растения – это самый богатый источник химического разнообразия на земле. Они синтезируют тысячи биологически активных соединений. Даже если в сегодняшних растениях гены, ответственные за синтез конкретного токсина молчат или выключены в результате селекции, это не значит, что информация о том, как эти токсины производить утеряна организмом навсегда. Сегодня ученые осваивают методы возвращения растению его былой дикости.
Сегодня, когда геном целого организма можно прочесть как заметку в газете, биологи изучают не плоские двумерные взаимосвязи наподобие функции рождаемости от урожайности, а многомерные «3D» и даже «4D» зависимости. Например, группа ученых из университета Невшателя в Швейцарии работает над загадкой системы «кукуруза-вредитель-энтомофаг-химические сигналы».
Им удалось выяснить, что дикий предок культивируемой сегодня кукурузы не утратил способность выделять в воздух привлекающие энтомофагов вещества. Энтомофаги – враги врагов кукурузы, а значит – ее друзья. Она не выделяет ядовитые для насекомых молекулы, но биохимически привлекает ос-наездниц, откладывающих яйца прямо в гусениц, уничтожающих посевы кукурузы.
Так почему же культурный потомок дикой кукурузы утратил способность производить такое полезное биохимическое оружие против гусениц? Для ответа на этот вопрос надо поближе посмотреть, как устроена защитная система растений против вредителей и патогенов.
Еще Иван Владимирович Мичурин для выведения зимостойкой груши скрещивал дикую уссурийскую с французским сортом. Как же ученые догадались, что дикие предки растений могут стать донорами зимостойкости, засухоустойчивости и других видов толерантности?
Итальянский ученый Комес более сотни лет назад предположил простую связь «фитоиммунитет – содержание биоактивных молекул». Другими словами, чем больше в клеточном соке дубильных веществ и органических кислот, тем устойчивее растение к болезням. Однако вскоре выяснилось, что такой «закон» выполняется далеко не для всех растений. В середине прошлого века Николаю Ивановичу Вавилову удалось обосновать связь фитоиммунитета с генетическими особенностями вида.
И поговорка «яблочко от яблони» приобрело новый – генетический – смысл. Созданная им коллекция культивируемых сортов послужила для выявления иммунных форм, и в том числе для селекционных работ последователей Мичурина. А разработанная Петром Михайловичем Жуковским теория сопряженной эволюции паразитов и их хозяев позволяет нам приблизиться к разгадке тайны утерянного культурными растениями иммунитета.
По-видимому, утраченная культивируемой кукурузой способность выделять в воздух аттрактанты ос-наездниц, связана с тем, что щедро одариваемая от поколения к поколению пестицидами она перестала участвовать в эволюционном отборе. Обрабатываемая кукуруза повышает урожайность и восприимчивые к болезни экземпляры не выявляются – они просто не успевают заболеть в заботливых руках агрономов.
Таким образом, в партиях зерна, оставленных для посева, появляется все больше и больше не прошедших сито эволюции зерен. Гены восприимчивых к болезням растений накапливаются из поколения в поколение. А патогены и вредители тем временем ищут не пути обхода биохимического оружия кукурузы, а вырабатывают невосприимчивость к пестицидам.
Мы вынуждены констатировать, что вступили в прямую эволюционную конфронтацию с вредителями растений. Способен ли многотоннажный химпром заменить наномолекулярные иммунные механизмы? История с ДДТ и хлорорганикой дает неутешительный ответ. Но наука не стоит на месте и человек в своем желании управлять природой уже приблизился к возможности ее скопировать.
В 1993 году были установлены структуры первых трех продуктов генов устойчивости растений, так называемых R-белков (resistance-protein). Сегодня такие гены и белки изучают в дикоросах, предках культивируемых растений, чтобы научиться использовать их для создания устойчивых к болезням сортов. Например, хорошо известный сегодня любителям здорового питания культурный имбирь, несмотря на огромное содержание самых разных фитонцидов, оказался восприимчив к корневой гнили, вызываемой грибоподобным организмом (оомицетом) рода Питиум.
В качестве донора генов устойчивости был взят дикорастущий имбирь. Оказалось, что в ответ на заражение питиумной гнилью, в диком имбире возрастает экспрессия гена, кодирующего особый белок, сходный по структуре с гликозил-гидролазами, ферментами, разрушающими компоненты клеточной стенки организмов рода Питиум.
В окультуренном имбире экспрессия (трансляция и транскрипция) этого гена по каким-то причинам снижена, хотя сам ген устойчивости в геноме присутствует. Разгадать загадку выключения или замолкания гена еще предстоит. Можно сказать, что ученые находятся пока в самом начале пути изучения молекулярно-генетических механизмов иммунитета растений. И все же, какие из изученных сегодня веществ могут сыграть ключевую роль в обеспечении пищевой безопасности населения Земли?
Чтобы растение смогло включить весь комплекс ответных реакций своего иммунитета на вторжение врага, оно должно сначала его распознать. Как это происходит? В ходе сопряженной эволюции вредителя и растения у вредителя в геноме появляются микропрограммы «нападения» – гены вирулентности, в которых закодирована информация, например, о синтезе ферментов, разрушающих клеточную стенку растения – пектиназ.
На каждый такой ген вирулентности у растения есть ген устойчивости, который регулирует работу целого комплекса программ по борьбе с продуктами вражеской жизнедеятельности. Так в ответ на появление в клеточной стенке продуктов генов авирулентности – определенных белков и полисахаридов – растение вырабатывает разрушающие организм противника ферменты, например, хитиназу.
А такой гормон как жасмоновая кислота активирует экспрессию генов, продукты которых токсичны для патогенов. Что это за продукты? Теперь это не хитиназы и не гидролазы, но все так же молекулы белковой природы – антимикробные пептиды – тионины, дефензины, альфа-харпинины и другие.
Итак, мы видим, что весомый вклад в иммунитет растений вносят самые разные белковые молекулы – R-белки, ферменты, антимикробные пептиды. Многие защитные белковые молекулы относятся к группе так называемых пептидов – «младших братьев» белков. Пептид, как и белок – длинная полимерная молекула, состоящая из повторяющихся блоков, аминокислот.
Разделение белков и пептидов на разные группы весьма условно и заключается в количестве аминокислот: менее сотни – пептид, более – белок. Единственная замена одной аминокислоты на другую в нитках «пептидных бус» может приводить к полной потере свойств молекулы, или приобретению новых функций. Например, замена глутаминовой кислоты на валин в шестом положении одной из пептидных цепей гемоглобина человека приводит к заболеванию серповидноклеточной анемией, но одновременно дает носителю такого гемоглобина невосприимчивость к возбудителю малярии.
Чтобы пептиды компактно упаковывались в клетках они сворачиваются в спирали (вторичная структура), наподобие химически завитых волос. Кстати говоря, химическая завивка волос как раз происходит благодаря разрушению и образованию новых дисульфидных связей в молекулах белка кератина при помощи химического реагента. Связи между молекулами серы могут скреплять несколько пептидных «спиралек» между собой (третичная структура).
Однако знание аминокислотных последовательностей, вторичной и даже третичной структуры молекул пептидов все равно не позволяет исчерпывающе ответить на вопросы о механизме работы этих молекул. Ведь они синтезируются в организме в результате считывания информации, закодированной в генах. А как работает геном, те есть как в каждом конкретном случае считывается или не считывается информация в геноме, науке пока не известно: почему в разных клетках включаются разные гены, как заставить ген «замолчать», усилить или ослабить его работу?
Сегодня ученые знают, что каждый ген взаимодействует с множеством регуляторов белковой природы. В то же время белки синтезируются в организме в результате считывания информации, закодированной в генах. Регуляция уровня экспрессии гена осуществляется также белками и пептидами. К тому же в каждом аминокислотном тексте пептида может быть записано несколько различных функций. Поэтому работа пептидов на молекулярно-генетическом уровне – один из самых крепких орешков для биохимиков сегодня.
Сегодня благодаря работе ученых нам известно, что белковые молекулы играют одну из ключевых ролей в растительном иммунитете. Существуют так называемые антимикробные пептиды, помогающие растению бороться с бактериальными и грибными болезнями, пептиды, обладающие инсектицидной активностью – циклотиды, пептиды с универсальным, цитотоксическим механизмом действия и многие другие, которые еще предстоит изучить. Но с чего же все начиналось?
Первые растительные антимикробные пептиды – пуротионины – были открыты в 1942 году Боллом в семенах пшеницы. Название «пуротионины» они получили благодаря высокому содержанию серы в своем составе (от греческого thio – сера и puro – пшеница). Первым делом исследователям было интересно узнать, насколько широк спектр антимикробного действия новых веществ.
Тогда смесь нескольких тионинов из пшеницы разделили на отдельные пептиды и протестировали каждый на разных видах бактерий. Выяснилось, что каждый конкретный тионин имеет свой узкий круг «предпочитаемых» врагов: альфа-пуротионины убивают возбудителя бактериальной пятнистости фасоли, но бессильны против бактерий Ralstonia solanacearum, а бэта-пуротионины действуют ровно противоположным образом.
Такая комплементарность (взаимодополняемость) действия различных пептидов в растительных клетках иллюстрирует, с одной стороны, специфичность их действия и способность избирательно действовать на конкретную мишень, не нанося вреда «полезной» микробиоте, а с другой – дает возможность смешать такой «коктейль» пептидов, который будет способен как в рекламе известного чистящего средства побороть все известные микробы.
Такие уникальные свойства растительных пептидов заставили ученых выделить и изучить более трех сотен растительных пептидов за последние десятки лет. Более трети из них были изучены за последние годы благодаря двум основным факторам: потребности человека в новых типах антибиотиков и совершенствованию методов выделения и изучения пептидов в лабораториях.
Сегодня кроме уже знакомых нам тионинов ученым известно еще семь так называемых семейств антимикробных пептидов растений, каждое из которых отличается своей уникальной структурой и свойствами, то есть потенциально несет в себе огромное количество неизученных возможностей для усиления иммунитета, как растений, так и человека.
Как же должен поступить исследователь, разыскивающий самые эффективные, самые «злые» растительные антимикробные пептиды? Идя по следам Мичурина и Вавилова, он может предположить, что носителями самых сильных пептидов иммунитета будут дикие предки культивируемых сегодня растений.
Так и сделали ученые из Института биоорганической химии имени М. М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова и Тюменского государственного университета. Изучая пептиды таких дикоросов как ежовник «куриное просо» и звездчатка (мокрица) они открыли новое – восьмое – семейство антимикробных («шпилечных») пептидов растений и «научили» бактерий выделять эти пептиды в окружающую их среду – культуральную жидкость.
Кстати, таким способом сегодня получают инсулин и некоторые другие важные для человека белки, так как это позволяет существенно снизить стоимость их производства. Антимикробные пептиды из звездчатки, полученные в ИБХ, теперь «умеет» синтезировать в своих клетках табак и банан.
Исследования цветков одуванчика позволили обнаружить в них новые, ранее неизвестные антимикробные пептиды, отличающиеся от уже известных. При этом в зрелых семенах-крылатках были найдены только запасные белки – альбумины (2S), которые способны защищать растение от грибных болезней. «Подарок» ученых помог этим растениям противостоять патогенным микроорганизмам, банан поборол серьезное заболевание – фузариоз.
Удалось даже заглянуть за «завесу» молекулярных механизмов действия антимикробных пептидов диких растений. Оказалось, что некоторые из них мультифункциональны. Такие пептиды могут одновременно ингибировать пищеварительные ферменты насекомых, снижая их аппетит, и разрушать клеточную стенку грибов или бактерий, избавляя растение от патогенных микроорганизмов.
В работе ученых возникающих вновь вопросов всегда больше, чем найденных ответов. Такие вопросы еще сильнее подогревают интерес к изучению растительных пептидов и воодушевляют исследователей на новые открытия. Что еще предстоит выяснить об антимикробных пептидах растений? Какие из закодированных в геноме пептидов перестают синтезироваться в растении?
При каких условиях это происходит? Какие механизмы отвечают за доставку пептидов в нужные органеллы клеток? Как именно пептиды культурных видов, сохраняя высокую степень структурного сходства с пептидами дикоросов, утрачивают свою активность? Оказалось, например, что два разных по своей биологической активности пептида из звездчатки кодируются одним общим геном.
За счет какого механизма в считывании информации с генома происходит такое разделение? Виноваты ли здесь белковые регуляторы? Может ли такой механизм использоваться для «возвращения» культурным растениям «дикого» иммунитета? Ответы предстоит найти в самое ближайшее время, ведь благодаря исследованиям в пептидной биохимии растений наши знания о молекулярных основах врожденного иммунитета растут, а значит, растет и «боевая мощь» человека, вступившего в прямую эволюционную борьбу с вредителями и болезнями растений. За кем останется последнее «слово» в генетических и пептидных текстах – покажет время.
Текст подготовлен Щукиной Верой Дмитриевной, магистранткой Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К. А. Тимирязева (Москва), Васильченко Алексеем Сергеевичем, кандидатом биологических наук, научным сотрудником Института экологической и сельскохозяйственной биологии Xbio и Тюменским государственным университетом (Тюмень) и Рогожиным Евгением Александровичем, кандидатом химических наук, научным сотрудником Институт биоорганической химии имени М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук (Москва).
Статья посвящена памяти ведущего российского ученого в области изучения защитных белков и пептидов растений, доктора химических наук, профессора Егорова Цезия Алексеевича (08.04.1935 – 04.01.2012).
